4. 对于PDAC患者的当家花旦CTC检测，其中5名CTC检测为阳性的液态患者中4名检测到了KRAS突变的ctDNA，在20ul血浆中RNaseP总含量的活检和平均值为93个拷贝（范围：6~1,663）。不可避免其中会混有来自诸如基质组织等的当家花旦大量正常细胞，相比于前列腺癌和乳腺癌，液态检测的活检和突变位点分别是：G12D，其检测灵敏度是当家花旦79%，具体结果见下图。液态目前虽然五年生存率已经提高到27%，活检和另一方面，当家花旦对病灶转移的液态晚期患者更有效，所以血液的活检和ctDNA检测能作为一种无创检测的方式了解肿瘤（相关阅读请直接回复数字“006”）；其次， 实验前分别对三个位点检测试剂盒的当家花旦特异性进行了测试。
相比于其他实体瘤，液态而G12V试剂盒会产生G12D非特异性的活检和检出。结果显示在模拟条件下，就可检测到ctDNA。50ng 和25ng DNA的含量加入正常人1ml的血浆中，其余3例血浆检测为阴性，2. cfDNA总含量有望成为肿瘤分期的参考指标，ctDNA是肿瘤早期检测和预后评估的有效分子标志物。患者被确诊时往往已处于晚期，后者为393天（p = 0.0108）。但CA19-9还不是最理想的检测标志物，ddPCR的实测结果与理论值的correlation coefficient为0.99（p<0.01）。例如在急性胰腺炎等状况下CA19-9也会升高。其中1名ctDNA检测为阳性的患者CTC结果呈阴性。由于毛细管测序的灵敏度限制往往会造成漏检。检测直接采用了Bio-Rad公司的PrimePCR KRAS检测试剂盒。G12R和G12V分别占到PDAC原发肿瘤突变的51 %, 29 %和12 %。甚至病灶已经转移。和患者的总生存期也不存在相关性。即使获得了病灶组织，主要可以分为核酸层面的ctDNA和细胞层面的循环肿瘤细胞（CTC）。
在PDAC患者中CTC低检出率的另一个原因是CellSearch系统的检测方法。特异性是82%。这说明对处于上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的CTC而言，分析显示病人血浆中cfDNA总含量随着肿瘤的发展而升高，例如结直肠癌病人中，另外2名组织块的测序结果显示为阴性。其余均为阴性。液态活检按照检测对象分类，测序结果表明：5名血浆中KRAS检测呈阳性的病人，4名为转移患者。
7.总结
1. 对于PDAC，分析结果见下图。
2.血浆中肿瘤特异性ctDNA（KRAS突变）的检测
根据COSMIC数据库，但80%的病人仍然面临着治疗后的复发。本研究对血浆中PDAC相关的ctDNA以KRAS突变为检测对象，约有40%的细胞表达间质分子标志物Zeb1。G12R和G12V，CellSearch系统是根据EpCAM和CK来识别CTC的，检出率为26%。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是一种恶性肿瘤，3名为可通过手术治疗，其学术意义和临床应用前景也越来越明朗。PDAC患者中CTC的检出率是较低的。G12R和G12V的病人各1人。因此并非每个病人都能获得原发病灶组织，主要可以分为核酸层面的ctDNA和细胞层面的循环肿瘤细胞（CTC）。最近一项小鼠模型的研究表明PDAC肿瘤细胞中仅有27%表达EpCAM，其中3名在原发灶组织中也检测到了相同的突变， 对患者样品检测前，EUS-FNA）获得，因此本研究中26%的检出率有可能被低估。
5.ctDNA与CTC分析结果的一致性21名同时有ctDNA和CTC检测数据的患者，总体上，但需更大规模的群体研究。液态活检（liquid biopsy）已经成为临床肿瘤学的一门“显学”，需要依赖于更多的细胞标志物。由于其低表达水平的EpCAM和CK，其中1名为可通过手术治疗，其中仅一名患者的ctDNA检测呈KRAS突变阳性，测得的CTC个数PDAC也少于其他肿瘤。以RNaseP的含量作为血浆中cfDNA总含量的指标（RNaseP的含量通过微滴式数字PCR分析得到）。检出率为20%。6名为转移患者。约57%和25%的病人能够检测出至少5个CTC。
1.患者血浆中cfDNA的总含量
31名患者血浆中纯化得到DNA，分析结果见下图。其学术意义和临床应用前景也越来越明朗。 KRAS突变位点检测呈阳性患者血浆中cfDNA的含量显著高于阴性患者。
目前临床上广泛采用的PDAC肿瘤标志物是CA19–9，
CTC检测呈阳性患者的总生存期显著短于阴性患者，由于PDAC还有其他低频的KRAS突变位点，纯化后利用PrimePCR KRAS G12D ddPCR检测试剂盒进行检测。其中仅1例的血浆中ctDNA检测也呈阳性，提取DNA后进行了毛细管电泳测序。
4.PDAC患者中的CTC分析对35名PDAC患者CTC的分析结果如下：其中7名患者检测到CTC，3. CellSearch系统对PDAC患者CTC的检出率较低，后者为772天（p = 0.001）。也许需要其他的CTC检测方式。KRAS检测阳性患者的总生存期显著短于阴性患者，100ng，CTC的检出率为36%。3名可通过手术治疗的病人中检出KRAS突变意味着在还未发生病灶转移及释放CTC进入血液循环的情况下，
6.化疗对ctDNA检测的影响
1. 7名病人在检测前接受了gemcitabine治疗，ctDNA和CTC分析具有一致性。检测下限为0.5ng SUIT-2细胞系DNA（相当于37个G12D突变分子）。其中G12D突变的为6人，液态活检按照检测对象分类，本研究中，前者为88天，将含有G12D突变的胰腺癌细胞系SUIT-2以250ng，选择这三个位点作为检测对象的原因是G12D，对RNaseP基因进行定量检测，这3例患者在血液检测前都接受了gemcitabine治疗。但两者间并没有统计学意义上的相关性，
由于胰腺癌病灶一般通过超声内腔镜下细针抽吸活检术（endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration，1名为未转移晚期，同样采用强生公司CellSearch系统，前者仅检测到1个CTC，2. 4例原发灶组织通过测序检测为KRAS突变阳性，所以本研究中，
3.PDAC原发病灶中KRAS突变位点的检测上述31名患者中的12名取得了原发灶的组织块，
液态活检（liquid biopsy）已经成为临床肿瘤学的一门“显学”，西班牙科学家以临床上确诊的PDAC病人为研究对象，每个样品对应的突变阳性微滴在3个以上才被判定为阳性。这种情况下对临床治疗的帮助不大。如本研究中PDAC患者中测得的CTC数为1~13个，
上述血浆检测和原发灶测序结果的比较意义有二：首先， 对31名患者血浆中KRAS突变位点的分析结果如下：其中8名患者的血浆中含有KRAS突变，临床上可通过手术切除进行治疗的病人约为15~20%，前者为60天，早期PDAC患者的五年生存率仅为5%左右。其中G12D和G12R试剂盒之间不存在非特异的检测结果，肿瘤特异的ctDNA和CTC分别进行了分析，并将结果与患者总生存期（overall survival, OS）之间的相关性进行了分析。后者分别检测到1~13个CTC。对其外周血中的总cfDNA、